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SHERLOCK tras los pasos del SARS-CoV-2
Autor:
Prof. Alejandra Ratti,
Departamento de Bioingeniería
Llevamos más de año y medio hablando del coronavirus, del COVID y de cómo detectarlo. Si bien existen varias pruebas para detectar la presencia del virus, desde la técnica molecular de PCR hasta las más sencillas de detección serológica, aún hay mucho camino por recorrer, sobre todo para la búsqueda de técnicas eficaces, sencillas y de bajo costo.
Dentro de este espectro de técnicas de detección también están consideradas las “caseras”, aquellas que permiten al usuario realizar el test desde la comodidad de su casa y en muchos casos, sin tener que enviar la muestra para su posterior análisis. Actualmente, investigadores del Instituto Wyss del Instituto Tecnológico de Massachusetts (MIT) se encuentran desarrollando y probando, junto con hospitales de la zona de Boston, una prueba de diagnóstico basada en CRISPR que permite a los usuarios probarse ellos mismos para el SARS-CoV-2 y múltiples variantes del virus utilizando una muestra de su saliva en casa, sin necesidad de instrumentación adicional.
El dispositivo de diagnóstico, llamado SHERLOCK instrumentado mínimamente (miSHERLOCK), es fácil de usar y proporciona resultados que pueden ser leídos y verificados por una aplicación de teléfono inteligente adjunta en una hora. Distinguió con éxito entre tres variantes diferentes de SARS-CoV-2 en experimentos y se puede reconfigurar rápidamente para detectar variantes adicionales como la Delta. El dispositivo se puede ensamblar usando una impresora 3D y componentes comúnmente disponibles por alrededor de US $15, y la reutilización del hardware reduce el costo de los ensayos individuales a US $6 cada uno.
Los investigadores crearon una reacción SHERLOCK diseñada para cortar el ARN del SARS-CoV-2 en una región específica de un gen llamado nucleoproteína que se conserva en múltiples variantes del virus. Cuando las tijeras moleculares, una enzima llamada Cas12a, se une con éxito al gen de la nucleoproteína y lo corta, también se cortan las sondas de ADN monocatenario, lo que produce una señal fluorescente. También crearon ensayos SHERLOCK adicionales diseñados para apuntar a un panel de mutaciones virales en secuencias de proteínas Spike que representan tres variantes genéticas del SARS-CoV-2: Alfa, Beta y Gamma.
Imagen 1. Pasos para la detección de SARS-CoV-2 y las regiones del genoma analizadas.
Fuente. De Puig et al (2021).
Los investigadores desarrollaron una técnica novedosa para resolver ese problema. Primero, agregaron dos químicos llamados DTT y EGTA a la saliva y calentaron la muestra a 95 ° C durante tres minutos, desactivando las enzimas que producían la señal falsa positiva de la saliva sin tratar y cortaron las partículas virales. Luego incorporaron una membrana porosa que fue diseñada para atrapar ARN en su superficie, que finalmente podría agregarse directamente a la reacción de SHERLOCK para generar un resultado.
Para integrar la preparación de la muestra de saliva y la reacción de SHERLOCK en un diagnóstico, el equipo de científicos diseñó un dispositivo simple que funciona con baterías con dos cámaras: una cámara de preparación de muestras calentada y una cámara de reacción sin calefacción. Un usuario escupe en la cámara de preparación de muestras, enciende la calefacción y espera de tres a seis minutos a que la saliva penetre en el filtro. El usuario quita el filtro y lo transfiere a la columna de la cámara de reacción, luego empuja un émbolo que deposita el filtro en la cámara y perfora un depósito de agua para activar la reacción SHERLOCK. 55 minutos después, el usuario mira a través de la ventana del transiluminador hacia la cámara de reacción y confirma la presencia de una señal fluorescente. También pueden utilizar una aplicación de teléfono inteligente que analiza los píxeles registrados por la cámara del teléfono inteligente para proporcionar un diagnóstico claro positivo o negativo.
Los investigadores probaron su dispositivo de diagnóstico utilizando muestras clínicas de saliva de 27 pacientes COVID-19 y 21 pacientes sanos, y encontraron que miSHERLOCK identificó correctamente a los pacientes COVID-19 positivos el 96% de las veces y a los pacientes sin la enfermedad el 95% de las veces. También probaron su rendimiento contra las variantes Alfa, Beta y Gamma del SARS-CoV-2 al agregar saliva humana sana con ARN viral sintético de longitud completa que contiene mutaciones que representan cada variante, y encontraron que el dispositivo era efectivo en una variedad de ARN viral. Concentraciones.
Funcionamiento del dispositivo desarrollado:
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