Tejidos vegetales como andamios naturales 3D para la regeneración de tejido adiposo, hueso y tendón

La descelularización es el proceso por el cual se eliminan todos los componentes celulares y nucleares de un tejido o un órgano para prevenir una respuesta inmunitaria inicial mientras se preserva la ultraestructura y composición de la Matriz extracelular nativa (MEC), debido a que las condiciones morfológicas y bioquímicas de las matrices descelularizadas son favorables para la adhesión, proliferación y diferenciación celular. Las estructuras descelularizadas también muestran una respuesta inmunogénica disminuida en el huésped después de la implantación en comparación con los trasplantes alogénicos y xenogénicos porque la inmunogenicidad está vinculada a los componentes intracelulares que se eliminan durante el proceso de descelularización.

Los tejidos animales descelularizados se han utilizado durante mucho tiempo en ingeniería de tejidos, en forma de sólidos porosos, en polvo y gelificado para formular hidrogeles, obteniendo resultados prometedores, a pesar de esto; las fuentes animales y humanas son controvertidas y se ven afectadas por una disponibilidad limitada, altos costos de producción y preocupaciones éticas. Además, la variabilidad entre diferentes donantes es un aspecto crítico en aplicaciones clínicas. Los andamios descelularizados de tejido vegetal podrían superar los problemas de disponibilidad, los altos costos y las preocupaciones éticas relacionadas con el uso de fuentes animales, dado su fácil disponibilidad, bajo costo, facilidad de uso y ausencia de cuestiones éticas, además que los tejidos vegetales exhiben una buena citocompatibilidad   y biocompatibilidad.

En el reino vegetal existe una amplia variedad de arquitecturas; por lo que se podrían seleccionar andamios derivados de plantas descelularizados dependiendo de su estructura y propiedades nativas para imitar una multiplicidad de tejidos de mamíferos. 

En este paper los autores eligieron, manzana, zanahoria y apio para descelularizarlos debido a que se caracterizan por poseer diversas arquitecturas internas, caracterizándolos morfológica, física y mecánicamente e investigaron el potencial in vitro como andamios para la regeneración en tejido adiposo, óseo y tendón.  

Para ensayar la descelularización de los tejidos vegetales, primero cortaron en rodajas con 2 mm de grosor, con un biopsy punch se extrajeron muestras cilíndricas de 10 mm de espesor, para las pruebas mecánicas se extrajeron muestras de 4 mm de diámetro y de longitud L = 25 mm.

Para descelularizar el tejido vegetal sumergieron cada muestra en 5 ml de solución de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,1 % p/v durante 48 h a temperatura ambiente con agitación continua. Luego de 24 h, sonicaron las muestras durante 5 min a 40 °C y cambiaron la solución SDS, las muestras se lavaron tres veces en agua destilada y en CaCl2 100 mM durante 24 h. 

Como control usaron muestras de las plantas (APctr, CActr y CEctr) que no se trataron mediante el proceso de descelularización. Tanto las muestras descelularizadas como las de control se lavaron tres veces en agua destilada y posteriormente se incubaron con penicilina/estreptomicina al 1 % p/v y anfotericina B al 1 % p/v durante 3 h con agitación a 140 rpm. Finalmente, las muestras se desinfectaron en una solución de etanol al 70% v/v durante 1 h, se lavaron tres veces en agua destilada estéril y se congelaron a -20 ◦C durante la noche. A continuación, las estructuras obtenidas fueron liofilizadas y se esterilizaron mediante radiación UV durante 15 min por cada lado.

Luego del procedimiento de descelularización se evaluaron los cambios volumétricos y daño estructural en las distintas muestras, encontrando que la contracción máxima registrada en los andamios fue de 6% (zanahoria). 

Cada muestra absorbió agua (, de 24 a 66 veces su peso anhidro inicial) y alcanzó un valor de meseta durante la primera semana de inmersión, demostrando la capacidad de las muestras para retener el fluido absorbido.  Las manzanas alcanzaron pesos estables después de 24 h y las muestras de zanahoria y apio después de 7 días de incubación. La variación de peso para las muestras derivadas de manzana y zanahoria fue de 4500 y 2450 %, respectivamente, sin diferencias entre los tejidos descelularizados y los nativos (p > 0,05). La variación de peso en los andamios derivados de apio fue del 6660 %, con un aumento significativo en la absorción de agua para las muestras descelularizadas en comparación con el tejido nativo (p < 0,05). Probando así que la capacidad de conservar agua luego de la descelularización. Con microscopia electrónica observaron 

Estos datos prueban que la peculiar presencia de una gran cantidad de agua en los tejidos vegetales se conserva después de la descelularización y que la estructura obtenida es así capaz de absorber fluidos, fundamentales para la supervivencia de las células en el volumen tisular. De hecho, la retención de agua es un aspecto crucial para el desarrollo de andamios exitosos capaces de sustituir los tejidos corporales naturales. Luego se realizó un análisis de microscopía electrónica de barrido en donde observaron que los tejidos vegetales descelularizados conserva una estructura tridimensional altamente porosa, sin alteración de la morfología. Al hacer las pruebas de citotoxicidad celular encontraron un 95% de viabilidad celular y no hubo diferencias significativas en el crecimiento celular en los grupos control y el descelularizado. 

Figura 2: Imágenes de estereomicroscopía de manzana, zanahoria y apio

Los andamios derivados de manzana tuvieron una porosidad relativamente grande y homogénea, adecuada para la regeneración del tejido adiposo, con un tamaño de poro superior a 100 µm es adecuado para un suministro eficiente de oxígeno y nutrientes. Las muestras derivadas de manzana descelularizadas e hidratadas se caracterizaron por un módulo de compresión de 4,17 ± 0,17 kPa; esto es comparable al tejido adiposo humano nativo. No se observaron diferencias estadísticas entre los módulos elásticos de las muestras descelularizadas y de control. Utilizando la línea celular preadipogénica (3T3-L1) se midió la actividad metabólica de las células cultivadas en andamios derivados de manzana aumentó a lo largo de los 14 días de cultivo, demostrando la capacidad de los andamios de manzana para sostener el crecimiento y proliferación de preadipocitos. Después de 14 dias de cultivo con la tinción Oil Red O se observaron células adiposas diferenciadas, que poseían una acumulación intracelular de lípidos 

Los andamios descelularizados de zanahoria presentaron una estructura homogénea con poros mas grandes en la región periférica (130 ± 26 µm de tamaño promedio) comparados con los poros ubicados en la región central (70 ± 12 µm de tamaño promedio), los cuales son comparables a las usadas para tejido óseo. Las pruebas de compatibilidad se realizaron in vitro utilizando con la una línea celular de preosteoblastos (MC3T3-E1). La actividad metabólica resultó estable hasta 7 días después de la siembra, los andamios de zanahoria mantuvieron el crecimiento y la proliferación de células preosteoblásticas. La actividad de fosfatasa alcalina ALP se investigó después de 14 días de cultivo en andamios derivados de zanahoria. Las células colonizaron uniformemente las paredes de los poros de los andamios de zanahoria, asumiendo una morfología alargada, típica de las células adheridas.

Los andamios derivados del apio se caracterizaron por una estructura orientada longitudinalmente, constituida por poros de 125 ± 11 µm alineados para formar canales paralelos, este tipo de estructura imita el alineamiento de los tendones. Estos andamios resistieron un 20 % de tensión sin fallar. El módulo elástico E de los andamios de apio descelularizados es igual a 0,59 ± 0,09 MPa, sin diferencia estadística (p < 0,05) con respecto al control. La citocompatibilidad directa in vitro se investigó utilizando L929, una línea celular de fibroblastos. La actividad metabólica aumentó hasta que se alcanzó un valor de meseta.  La tinción LIVE/DEAD confirmó la presencia de células L929 viables adheridas a los andamios de apio descelularizados.  Se observó alineación celular en varias regiones de la superficie del apio mediante tinción VIVO/MUERTO, las muestras tuvieron un ángulo de alineación <20◦ Esto es comparable al porcentaje de células alineadas observado en andamios orientados desarrollados previamente dirigidos a la ingeniería de tejidos tendinosos. También se detectaron regiones organizadas al azar, donde las células se caracterizan por una morfología redonda sin orientación preferencial, lo cual es consistente con la estructura de los tendones nativos, caracterizados por haces de fibras de colágeno alineadas rodeadas por una matriz interfascicular blanda, con una estructura menos definida y orientada. 

Referencias 

[1]N. Contessi Negrini, N. Toffoletto, S. Farè, and L. Altomare, “Plant Tissues as 3D Natural Scaffolds for Adipose, Bone and Tendon Tissue Regeneration,” Front. Bioeng. Biotechnol., vol. 8, no. June, pp. 1–15, 2020, doi: 10.3389/fbioe.2020.00723.